BAB I
PENDAHULUAN
I.1 Prinsip Percobaan
Berdasarkan bentuk pertumbuhan koloni dan karakteristik pada bakteri.
II.2 Tujuan Percobaan
Untuk mempelajari dan mengetahui bagaimana bentuk pertumbuhan, koloni dan karakteristikpada bakteri.
BAB II
LANDASAN TEORI
II.1 Teori Dasar
Adanya pertumbuhan mikroorganisme dalam suatu media dapat ditunjukkan dengan adanya perubahan pada permukaan atau seluruh bagian media tersebut. Dalam makanan misalnya, adanya lapisan putih/ abu-abu pada permukaan roti, ‘mulurnya’ kuah sop atau penggumpalan susu dan adanya aroma asam manunjukkan telah terjadi kontaminasi oleh mikroorganisme.
Sayangnya pertumbuhan mikroorganisme tersebut tidak dapat dilihat jelas secara visual. Secara umum, adanya kontaminasi hanya dapat terlihat sebagai bintik- bintik/ gumpalan/ lapisan yang berwarna putih, abu-abu, kadang-kadang kuning atau merah. Keadaan seperti itu disebabkan oleh pertumbuhan koloni yang bertumpuk, biasanya terdiri dari banyak jenis. Kelompok atau jenis mikroorganismenya tidak dapat ditentukan dengan mudah, sehingga perlu dilakukan proses pemisahan bertahap yang disebut: isolasi, kemudian dilanjutkan dengan identifikasi berdasarkan sifat-sifat biokimianya.
Reaksi identifikasi yang umum dilakukan untuk bakteri adalah: melihat gerakannya (motilitas), adanya komponen sel yang khas (spora, kapsul), pewarnaan gram dan sifat biokimia seperti IMVIC (reaksi pembentukkan indole, sifat asam dengan indikator metil merah, voges-proskauer, inositol dan pertumbuhannya dalam media cimmon’s citrate) serta beberapa reaksi pembentukkan gula pada media TSIA (Triple Sugar Iron Agar).
BAB III
METODOLOGI PERCOBAAN
III.1 Disiapkan bahan dan alat berikut:
| No. | NAMA BAHAN/ ALAT | JUMLAH/ KELOMPOK | KETERANGAN |
| 1 | Kaca objek + tutup | 5 set | Tidak perlu steril |
| 2 | Kaca obyek tetes gantung | 1 buah |
| 3 | Kultur solate bakteri | 2 jenis | Koloni putih |
| 4 | Larutan fukhsin | 5 ml | Tidak perlu steril |
| 5 | Larutan asam sulfat 1% | 5 ml |
| 6 | Pewarna biru metilen | 5 ml |
| 7 | Air steril | 5 ml |
| 8 | Minyak imersi | 5 ml |
| 9 | Safranin | 5 ml |
| 10 | Karbol gentian violet | 5 ml |
| 11 | Lugol | 5 ml |
| 12 | Alkohol | 5 ml |
| 13 | Kertas saring | Secukupnya |
III.2 Pergerakan Bakteri
1. Disiapakan kultur bakteri hasil isolasi dari P-3. Pilih koloni yang dapat memberikan ciri pertumbuhan yang terbaik, misalnya: koloni putih, kuning, abu-abu, atau yang lain.
2. Siapakan juga 2 buah kaca obyek yang telah dibersih dan kering.
3. Flambir sebuah kaca objek dan dibiarkan dingin, teteskan sedikit air steril dan oleskan dengan sedikit cuplikan kultur satu jenis bakteri tersebut. Campurkan kultur dengan air sehingga menjadi suspensi yang encer, kemudain ditutup dengan kaca penutup. Gerakan bakteri akan terlihat lebih jelas jika digunakan kaca obyek tetes gantung.
4. Preparat segar yang telah siap dilihat di bawah mikroskop, dan amati pergerakan bakterinya. Bakteri akan bergerak dengan arah atas-bawah atau kiri-kanan secara teratur . Gerakan yang tidak terarah bukan merupakan gerak bakteri.
Percobaan ini harus dilakukan dengan segera, karena bakteri akan cepat mati.
5. Lakukan percobaan di atas untuk 1 jenis mikroorganisme yang lain.
6. Catat pengamatannya dalam tabel untuk memudahkan dalam membandingkannya.
III.3 Pemeriksaan Spora Bakteri
1. Siapkan kultur bakteri isolat putih, kemudian disuspensikan sedikit sapuan bakteri dan tambahkan 1 tetes larutan fuksin.
Campurkan homogen kemudian panaskan di atas penangas air yang bersuhu 800Cselama 10 menit. Usahakan jangan sampai memdidih atau menjadi kering.
2. Oleskan tadi digenangi dengan larutan asam sulfat 1% selama 2 detik, lalu dicuci dengan air mengalir.
3. Genangi olesan dengan pewarna biru- metilen selama 5 menit
Kelebihan pereaksiwarna dibuang, kemudian dibilas lagi dengan air mengalir, dan selanjutnya dikeringkan dengan bantuan kertas saring. Usahakan olesan preparat tidak terhapus dengan tissu.
4. Teteskan sedikit minyak imersi di atas preparat,lalu di lihat dibawah mikroskop dengan perbesaran 10xdan dilanjutkan 100x.
5. Amati dan catat pengamatan mikroskop. Spora akan terlihat berwarna merah dengan dikelilingi sel vegetatif yang berwarna biru.
III.4 Pemeriksaan Kapsul Bakteri
1. Disiapkan biarkan isolasi bakteri jenis lain, pewarnaansafranin, minyak imersi. Sediakan pula 1 buah kaca obyek yang telah bersih dan kering.
2. Letakan sedikit sapuan kultur bakteri dan suspensi dengan 1 tetes air steril. Campurkan suspensi tersebut dengan larutan karbol gentian violet dengan bantuan ujung kaca obyek kedua dengan posisi sebelah kanan dan membentuk sudut 45odengan kaca obyek petama. Kaca obyek kedua ditarik ke arah kiri sehingga suspensi bakteri tersapu merata dengan membentuk lapisan tipis di atas kaca obyek.
3. Preparat difiksasi sebanyak 3 kali di atas nyala api, kemudian ,digenangi dengan larutan.
4. Safranin selama 5 menit. Pereaksi warna yang berlebih dibuang, dan dikeringkan dengan bantuan kertas saring.
5. Preparat dioleskan dengan sedikit minyak imersi, lalu diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran 10x dilanjutkan 100x.
6. Gambarkan hasil pengamatannya dengan teliti. Sel baktri kan berwarna merah dan kapsul bakteri akan terlihat sebagai bagian kosong (transpsran) di sekitar tumbuh bakteri.
III.5 Pewarnaan Gram untuk bakteri
1. Disiapkan 2 buah kaca obyek, isolat biakan(koloni lain lagi), karbol gentian violet, pereaksi lugol, alkohol 95%,pewarna safranin, minyak imersi.
2. Sapukan sedikit biakan isolat bakteri di atas kaca obyek, ditambah 1 tetes air, kemudian disuspensikan.
3. Kaca obyek diletakan di atas bak pewarna, kemudian digenangi dengan karbol gentian violet selama 1 menit. Kelebihan zat warna dibuang, dan di bias denhan air mengalir.
4. Olesan digenangin dengan lugol selama 2 menit, pereaksi berlebih dibuang, dan dibilas dengan air mengalir.
5. Olesan digenangi dengan alkohol tetes demi tetes selama 30 detik atau sampai semua zat warna hilang, kemudian dibilas dengan air mengalir.
6. Pewarnaan yang terakhir adalah dengan safranin selama 1 menit, kelebihan zat warna dibuang dan dibilas dengan air yang mengalir, kemudian dikeringkan dengan kertas saring.
7. Preparat dilihat dibawah mikroskop dengan perbesaran 10x atau 100x.
8. Hasil percobaan digambar dengan teliti. Sel bakteri yang berwarna biru menunjukan bakteri masuk kelompok gram positif, sedangkan bakteri Gram negatif akan berwarna merah. Bagiamana dengan isolat yang sudah di dapat, ada perbedaan kelompok Gram ada.
III.6 Identifikasi Bakteri dengan Media TSIA
| NO | NAMA BAHAN/ALAT | JUMLAH/KELOMPOK | KETERANGAN |
| 1. | Media TSIA (ada bagian tegak & miring) | 2 tabung kecil@2ml |
|
| 2. | Larutan pepton | 2 tabung kecil@1ml |
| 3. | Larutan alfa-naftol | 5 ml |
| 4. | Media MR-VP | 4 tabung@1 ml |
| 5. | Larutan KOH 10% | 5 ml |
|
1. Disiapkan 2 tabung reaksi kecil dan steril ,media TSIA, kultur bakteri isolat putih yang berbeda bentuk atau selnya.
2. Isikan median TSIA bersuhu 45oC setinggi 2 cmpada kedua tabung, kemudian diletakan di atas alas sehingga posisinya rendah. Usahan media membentuk posisi tegak dengan bagian atas miring tetepi tidak menyantuh kapas. Diamkan sekirat 30 menit hingga media menjadi padat.
3. Inokolasikan satu jenis kultur bakteri pada satu tabung dan jenis bakteri kedua pada tabung yang lain. Media tegak ditusukkan, sedangkan media yang miring digores.
4. Inkubasikan kedua tabung pada suhu 35-37oC selama 24-48 jam.
5. Catat pengamantannya sebagai berikut:
a) Bagian miring * berwarna kuning :laktosa/sakrosa(+)
* warna hitam : gas H2S (+)
b) Bagian tegak *berwarna kuning :glukosa (+)
*gelembung/media terangkai :gas (+)
*warna hitam :gas H2S (+)
III.7 Uji biokomia IMVIC untuk Bakteri
1. Disisapakan 8 buah tabung reaksi, suspensikan biakan 2 isolatbakteri (usahakan warnanya berbeda), air pepton, media MR-VP, media Cimmoon’s citrat, pereaksi kovacks, indikataor metil merah, larutan alfa-naftol, larutan KOH 10%.
2. Tabung nomor 1 & 5 : isi dengan 0,5 ml air pepton
Tabung nomor 2 & 6 dan 3 & 7: isi dengan 0,5 ml media MR-VP
Tabung nomor 4 & 8 : isi dengan 0,5 ml media Cimmon’s citrat(warna hijau).
3. Tabung 1-4 : diinukulasi dengan 1 ose bulat suspensi koloni-1 dan tabung 5-8 dengan suspensi koloni-2.
4. Semua tabung diinokulasi pada suhu 35-37oC selama 24 jam.
5. Tabung 1 & 5 : tambahkan 1 tetes pereaksi kovacks memalui dinding tabung secara hati-hati.adanya cincin berwarna merah
Menjukan indol (+).
6. Tabung 2 & 6 : tambahkan 1 tetes indikator metil merah (MM)
7. Tabung 3 & 7: tambahkan 1 tetes pereaksi alfa-nafton/dalam KOH10% . bila tarbentuk endapan warna merah bata berarti VP (+).
8. Tabung 4 & 8: amati warnanya; terjadinya perubahan warna media menjadi biru menunjukan citrat (+).
9. Bagaimanakan hasil uji IMVIC untuk pasangan untuk bakteri kedua.
BAB IV
HASIL PERCOBAAN
| No. | Pengamatan | Keterangan |
| 1. | Pergerakan Bakteri
| Pergerakan bakteri tidak terlihat, kemungkinan dikarenakan bakteri telah mati. |
| 2. | Pemariksaan Spora Bakteri
| Terlihat adanya spora . ~ Untuk MCA: terlihat spora berbentuk bulat kecil-kecil ~ Untuk MSA: terlihat spora berbentuk bulat pipih
|
| 3. | Pemerikasaan Kapsul Bakteri | Sel kapsul tidak terlihat,yang terlihat hanya warnanya merah karena larutan yang ditambahkan kedalamnya.
|
| 4. | Pewarnaan Gram untuk Bakteri | Sel bakteri tersebut berwarna: ~ Untuk MSA: (merah) menunjukkan bahwa bahwa bakteri tersebut memiliki pewarnaan gram (-) ~ Untuk MCA: (biru) menunjukkan bahwa bakteri tersebut memiliki perwarnaan gram (+)
|
| 5. | Identifikasi Bakteri dengan Media TSIA MCA MSA | Pada percobaan ini dua-duanya menggunakan media miring ~ Pada media 1: digores dengan isolate MSA dan terdapat koloni yang banyak berlendir pada daerah yang digores dan ditusuk dan media berwarna orange. ~ Pada media 2: digores dengan isolate MCA dan terdapat koloni yang sedikit berlendir dan media berwarna merah |
| 6. | Uji Biokimia IMVIC untuk Bakteri ~Tabung 1 & 5 (air pepton) Tabung 1 Tabung 2 | ~ Sebelum ditetesi pereaksi konvacks - Pada tabung 1:diinokulasikan menggunakan media MSA dan diindikasikan terdapat serabut kapang. - Pada tabung 5:diinokulasikan menggunakan media MCA dan diindikaikan lebih sedikit serabut dibandingkan MSA | ~ Setelah ditetesi pereaksi konvacs -Pada tabung 1:terbentuk cincin yang berwarna kuning kehijauan (-) -Pada tabung 5:terbentuk cincin yang berwarna merah (+) |
|
| ~ Tabung 2 & 6 (MR-VP) Tabung 2 Tabung 6 | ~ Sebelum ditetesi indikator Metil Merah (MM) -Pada tabung 2:diinokulasikan menggunakan media MSA, larutan menjadi berwarna keruh >>> yang diindikasikan hidupnya mikroorganisme -Pada tabung 6:diinokulasikan menggunakan media MCA, larutan menjadi berwarna keruh >> | ~ Setelah ditetesi indikator Metil Merah (MM) -Pada tabung 2:larutan berwarna kuning (-) -Pada tabung 6:larutan berwarna merah (+) |
|
| ~ Tabung 3 & 7 (MR-VP) Tabung 3 Tabung 7 | ~ Sebelum ditetesi pereaksi KOH 10 % -Pada tabung 3:diinokulasikan menggunakan media MSA, larutan menjadi berwarna keruh >>> yang diindikasikan hidupnya mikroorganisme -Pada tabung 7: diinokulasi menggunakan media MCA, larutan menjadi berwarna keruh >> | ~ Setelah ditetesi pereaksi alfa-naftol -Pada tabung 3: larutan keruh kekuningan (-) -Pada tabung 7: larutan keruh kekuningan (-) |
|
| ~ Tabung 4 & 8 (Cimmon’s citrate) | ~ Pada tabung 4: diinokulasikan dengan media MSA berwarna biru, citrat (+) ~ Pada tabung 8: diinokulasikan menggunakan media MCA berwarna hijau, citrat (-)
|
BAB V
PEMBAHASAN
Dalam mengidentifikasi bakteri, kita perlu mengamati pergerakan bakteri, pemeriksaan spora bakteri, pemeriksaan kapsul bakteri, pewarnaan gram, identifikasi bakteri dengan media TSIA, dan uji biokimia IMVIC untuk bakteri.
Pada pergerakan bakteri, yang diamati adalah bakteri dari media MSA dan MCA. Koloni yang berada pada media MSA berwarna kuning dan berlendir, sedangkan koloni yang berada pada media MCA berwarna kehitam-hitaman. Pada saat menggunakan kaca obyek harus dipanaskan terlebih dahulu agar steril dan dibiarkan kering lalu teteskan air steril dan suspensikan koloni tersebut dengan air steril itu. Pada saat diamati dibawah mikroskop ternyata tidak terlihat pergerakan bakteri, kemungkinan itu dikarenakan bakteri tersebut cepat mati.Langkah ini dilakukan untuk MSA maupun MCA.
Pada pemeriksaan spora bakteri, kita menyiapkan kultur bakteri isolate putih dari media MSA dan MCA, baik MSA maupun MCA yang disuspensikan kemudian ditambahkan larutan fukhsin kemudian mencampurkannya dan memanaskan diatas penangas air tidak sampai mendidih agar bakteri tidak mati, setelah itu menambahkan juga larutan asam sulfat 1% selama 2 detik lalu dicuci dengan aquadest kemudian kaca obyek digenangi dengan pewarna biru metilen lalu dibilas lagi dengan aquadest dan keringkan dengan kertas saring, setelah itu meneteskan minyak imersi diatas preparat kemudian dilihat dibawah mikroskop, dan terlihat adanya spora, untuk MCA terlihat spora berbentuk bulat kecil-kecil sedangkan untuk MSA terlihat spora berbentuk bulat pipih.
Pada pemeriksaan kapsul bakteri, menggunakan isolate bakteri jenis lain, pewarna safranin dan minyak imersi. Kultur bakteri yang telah disapukan pada kaca obyek kemudian disuspensikan dengan 1 tetes air steril. Suspense tersebut dicampur dengan larutan karbol gentian violet, lalu preparat difiksasi 3x diatas nyala api lalu digenangi dengan larutan safranin selama 5 menit, setelah itu mengoleskan sedikit minyak imersi dan dilihat dibawah mikroskop, kita tidak melihat adanya kapsul bakteri yang terlihat hanyalh warnanya yang berwarna merah akibat dari larutan yang ditambahkan kedalamnya.
Pada pewarnaan gram untuk bakteri digunakan media MSA dan MCA, koloni tersebut baik dari MSA maupun MCA disuspensikan dengan 1 tetes air diatas kaca obyek, kaca obyek tersebut disimpan diatas bak pewarna dan digenangi dengan karbol gentian violet selama 1 menit, lalu dibilas dengan air, kemudian digenangi dengan alcohol tetes demi tetes selama 10 detik sampai semua warna menghilang dan dibilas lagi dengan air mengalir, dan setelah itu pewarnaan yang terakhir yaitu dengan safranin selama 1 menit, zat warna yang berlebih dibuang dan dikeringkan dengan kertas saring dan mengamati dibawah mikroskop. Setelah diamati dibawah mikroskop, untuk MSA berwarna (merah) yang menunjukkan bahwa bakteri tersebut memiliki pewarnaan gram (-), sedangakan untuk MCA berwarna (biru) yang menunjukkan bahwa bakteri tersebut memiliki perwarnaan gram (+)
Dalam mengidentifikasi bakteri dengan menggunakan media TSIA, kita menggunakan media miring dua-duanya, sebelum digores menggunakan MSA dan MCA media berwarna merah tapi setelah digores dan didiamkan selama 3 hari dalam incubator, untuk MSA media menjadi berwarna kuning dan terdapat koloni yang banyak mengandung lendir pada daerah yang digores dan ditusuk (+), sedangkan pada MCA media masih tetap berwarna merah dan terdapat koloni yang sedikit berlendir jika dibandingkan dengan MSA (-).
Pada uji biokimia IMVIC pada bakteri menggunakan 8 tabung reaksi dan suspensi biakan 2 isolat bakteri yang warnanya berbeda. Pertama-tama tabung 1&5 diisi dengan 0,5 mL air pepton, 2&6 dan 3&7 diisi dengan 0,5 mL media MR-VP, 4&8 diisi dengan 0,5 mL media Cimmon’s citrate. Pada tabung 1-4 diinokulasikan dengan suspense koloni dari media MSA, tabung 5-8 diinokulasikan dengan suspension koloni dari media MCA. Semua tabung tersebut diinkubasi pada suhu 35˚-37˚.
Setelah diinkubasi, tabung 1&5 (pepton) ditambahkan 1 tetes pereaksi konvacks melalui dinding tabung, pada tabung 5 yaitu suspense koloni dari medi MCA terdapat cincin kuning kehijauanyang menunjukan indol (-), sedangkan pada tabung 1 yaitu suspensi koloni dari media MSA terdapat cincin berwarna merah yang menunjukan indol (+).
Pada tabung 2&6 (MR-VP) ditambahkan 1 tetes indicator Metil Merah (MM), pada tabung 2 yaitu suspense koloni dari media MSA, adanya pembentukan larutan warna kuning sehingga MM (-), dan pada tabung 6 yaitu suspensi koloni dari media MSA, adnya pembentukan larutan warna merahyang menunjukan MM (+).
Pada tabung 3&7 (MR-VP) ditambahkan 1 tetes pereaksi KOH 10%. Dan ternyata pada tabung tersebut tidak terbentuk endapan warna merah bata yang menunjukan VP (-).
Pada tabung 4&8 ( Cimon’s) setelah diamati ternyata pada tabung itu susupensi koloni dari media MSA, warna berubah menjadi berwarna biru yang menunjukan citrate (+), sedangkan pada tabung 8 yaitu suspense koloni dari media MCA, warna tidak berubah yaitu tetap berwarna hijau yang menunjukan citrate (-).
BAB V
KESIMPULAN
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukuan dapat disimpulkan bahwa :
· Pada pemeriksaan pergerakan bakteri, tidak terjadi pergerakan. Yang dikarenakan bakteri telah mati.
· Pada pemeriksaan spora bakteri, pada MCA terdapat spora bakteri yang berbentuk bulat-bulat kecil. Sedangkan pada MSA terdapat spora bakteri berbentuk bulat-bulat pipih yang memanjang.
· Pada pemeriksaan kapsul bakteri tidak terlihat adanya kapsul bakteri yang terlihat hanyalah warna pink karena reagen yang digunakan yaitu Metil Merah.
· Pada pewarnaan gram untuk bakteri, untuk MSA sel berwarna merah yang menunjukan bakteri masuk kelompok Gram negatif, sedangkan untuk MCA sel berwarna biru yang menunjukan bakteri masuk kelompok Gram positif.
· Pada idetifikasi bakteri dengan media TSIA pada MSA media berubah menjadi warna kuning yang menunjukan bakteri positif mengandung laktosa atau sakarosa. Sedangkan MCA tidak mengandung glukosa karena warnanya tetap merah.
DAFTAR PUSTAKA
tasyaariesta.wordpress.com/category/uncategorized/
· Pelczar, M.J. and E.C.S Chan, Dasar-dasar Mikrobiologi, jilid 1 dan 2, terjemahan Ratna Siri Hadioetomo dkk. , UI-Press, Jakarta, 2005
